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今天分享的是年7月24日发表在NatureCommunications的标题为“Single-celltranscriptomicanalysisinamousemodeldecipherscelltransitionstatesinthemultistepdevelopmentofesophagealcancer”的一篇文献。
背景介绍
食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第8位，而致死率居第6位。由于食管癌早期症状不明显，现阶段早期诊断率低，50%患者在诊断时已无法手术切除，5年生存率不足20%。
食管癌主要分为两种类型：食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophagealadenocarcinoma)。我国是食管癌的高发国家之一，全球大约70%病例发生在中国，中国食管癌约90%患者为ESCC。因此如果在食管癌研究中有突破将对临床有十分重要的意义。
食管癌由多种因素造成：
1.致癌物质：亚硝胺类化合物具有很强的致癌性
2.饮食习惯：长期吸烟、酗酒、吃热烫食物、咀嚼不细等，刺激、灼伤食道黏膜
3.维生素与微量元素的缺乏：饮食结构配比不合理
4.遗传因素与环境：食管癌具有遗传易感性，且在高风险地区中，有阳性家族史患者达20%~45%，其中男性患者较明显。
食管癌由多种因素造成，且食管鳞状细胞癌(ESCC)的发生是一个漫长的致病过程，了解其中的机理对于ESCC的治疗十分有意义的。
实验设计
化学致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）诱导小鼠ESCC发展的方式，与人体的ESCC致瘤性过程相似，因此作者采取小鼠动物模型模拟人体食管鳞状细胞癌的发生过程。
作者将8周雌鼠（C57BL/6mice），在饮用水中加4NQO（μg/mL），喂养处理16周，再用无菌水替代4NQO饮用水，喂养直到26周杀死小鼠。
定义6个时期：
1.正常NOR(0周)：正常的基底层和浅层分层
2.炎症INF(12周)：出现局灶性淋巴细胞聚集，说明在这个部位有炎症反应存在
3.增生异常HYP(20周)：发生在上皮的下三分之一处(thelowerthirdoftheepithelium)
4.增生异常DYS(22周)：发生在上皮的下三分之二处(lowertwothirdsoftheepithelium)
5.原位癌CIS(24周)：增生异常范围达到整个上皮时
6.浸润性癌ICA(26周)：侵入上皮下其他组织
结果
作者首先对小鼠的正常样本和致癌物处理的小鼠做了RNAseq分析，PCA结果发现，由于细胞异质性，传统的RNAseq无法解释恶性细胞的发展。于是采用单细胞转录组分析。
不同时期小鼠分别取样，NOR:30只，INF:20只，HYP:25只，DYS:17只，CIS:20只，ICA:23只。最终免疫细胞（T细胞，B细胞，髓样细胞，自然杀伤细胞）捕获到个，非免疫细胞（成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，肌细胞）捕获得个。
上皮细胞
作者将上皮细胞分成六个亚类，对其进行GSVA分析看不同cluster富集的通路。
EpiC1表达的基因与有丝分裂和细胞增殖相关，可能反映食管上皮细胞的自我更新能力。EpiC2表达与异物解毒有关的基因，很可能是由于4NQO影响导致机体做出的正常反应。EpiC3高表达对那些对细胞外致癌物质刺激，促炎症和Hif-1信号作出反应的基因。EpiC4表达与角质化有关的基因。EpiC5与EMT（上皮间质转化）以及血管生成有关。EpiC6高表达控制癌症侵袭性和转移的基因。
并对上皮细胞的细胞组成百分比做了分析，发现每类cluster的特征和时期都能对应上。并从中挑选出每类cluster的典型基因代表，绘制基因在不同时期的表达量变化图。
与此同时，还对6种上皮细胞亚类做了轨迹分析，发现Component1与细胞侵袭、EMT以及血管生成有关，反映了细胞的癌变趋势。Component2与细胞增殖有关，反映细胞分化趋势。
成纤维细胞
对成纤维细胞也进行了亚类分析，细胞组成变化以及GSVA分析。FibC1是NOR期的主要成分，然后随着肿瘤的发生而显着降低。FibC3细胞是INF期的主要成纤维细胞，具有很强的干扰素反应和MHC介导的抗原呈递活性，代表对组织损伤的初始免疫反应。从HYP阶段开始，成纤维细胞通过增加补体和趋化因子的表达积极募集免疫细胞。
T细胞
文章将T细胞分为CD4+,CD8+,以及两种双阴性T细胞。再接着将CD4+T,和CD8+T分成亚类。
对于CD8+T细胞来说，作者发现主要是表达幼稚与记忆标记基因，而不是细胞毒性的标记基因。在NOR阶段，主要细胞类型是幼稚细胞（CD8-TN1），而在INF阶段，主要细胞类型被记忆T细胞取代，即CD8+组织驻留记忆T（CD8-TRM）细胞和效应记忆T（CD8-TEM）细胞。但是这两种细胞在INF期后，随着癌症形成过程逐渐下降，说明并不是这两种细胞在癌前占主导，而是非效应CD8+T细胞起了主导重要。
对于CD4+T细胞来说，作者发现CD4-Th1-like,CD4-Th2,andCD4-Th17细胞对应三种主要的细胞介导效应免疫。
从HYP阶段开始，CD4-Th1-like细胞的比例下降，被CD4-Th2和CD4-Th17细胞替代。CD4-Th1细胞样表达通过激活单核细胞和响应干扰素γ从而显示出具有抗肿瘤能力。并且差异表达表明，CD4-Th1细胞样细胞比CD4-Th2细胞表达更高水平的免疫激活基因。CD4-Th17在INF时期被激活，在HYP阶段急剧增加，且产生高水平的Il22，Il17a和Rorc，这可能激活单核细胞并募集中性粒细胞以响应上皮损伤。
CD4+T细胞的抗肿瘤作用降低以及炎症反应增强，暗示在肿瘤发生过程中食管微环境中发生了从免疫类型1到类型3的免疫变化。
髓样细胞
作者发现，在11个髓样细胞簇中，单核细胞/巨噬细胞Mo/Mφ-C1，Mo/Mφ-C3，cDC2-C1，致耐受的比例树突状细胞（tDC）和中性粒细胞在肿瘤发生的各个阶段都发生了巨大的变化。
在INF期后，Mo/Mφ-C1细胞被Mo/Mφ-C3细胞替代，伴随着抗原呈递因子与补体表达量的下降，以及免疫抑制基因的表达增高，暗示免疫力下降以及肿瘤发育过程。自NOR阶段以来，随着代表免疫刺激活性的基因Icosl的下调，cDC2-C1的比例急剧下降。相反，高表达Cd，Pdcd1lg2和Ido1的免疫抑制tDC细胞在所有致瘤阶段均持续存在。此外还发现嗜中性粒细胞的数量不断增加。
验证人类ESCC样品的表达特征
为了对上述小鼠模型研究结果进行验证，作者从个4人类患者组织中取样进行表达谱验证。通过LCM获得的浸润性癌(ICA,n=9)、原位癌(CIS,n=6)、异型增生(DYS,n=17)和癌旁正常上皮(taNOR,n=8)的小块组织进行RNAseq测序。同样PCA证明，癌组织和非癌组织之间有界限，但是taNOR与DYS之间有重叠。在小鼠不同的上皮细胞簇中鉴定的六个代表性基因也在ESCC患者的癌前病变中表达，且表达趋势基本一致。由于LCM主要捕获上皮细胞，并且样品不适合分析其他细胞类型的状态，因此使用活检样品进行了bulkRNA-seq。结果还显示了肿瘤微环境中性粒细胞增加的趋势。
这些结果支持了作者在小鼠模型中的发现，并为理解ESCC的发展提供了新的线索。
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