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中华消化杂志,,41(3)刘晓波,高子夜,金曙,等.

摘要

目的

探讨食管癌患者食管微生态状况，并比较其与健康人群食管菌群的差异。

方法

选择年7月至年7医院就诊的82例食管癌患者和同期年龄、性别相匹配的20名健康对照者，30份食管癌病理组织根据分化程度分为低分化(8份)、中分化(9份)和高分化(13份)。采集食管癌患者和健康对照者的食管组织样本，提取样本DNA，对细菌16SrRNAV4区域行PCR扩增。运用IlluminaHiSeq测序平台测序，行α多样性分析和主坐标分析(PCoA)，采用线性判别分析效应量(LEfSe)的线性判别分析(LDA)值筛选差异物种，ROC曲线验证随机森林模型，BugBase数据库预测食管细菌表型。采用非参数Kruskal-WallisH检验和Wilcoxon秩和检验进行统计学分析。

结果

食管癌患者Chao1指数高于健康对照者[.51(.29，.13)比.83(.31，.74)]，差异有统计学意义(Z＝-2.，P＝0.)。PCoA显示食管癌患者和健康对照者样本间距离较近，两者微生态菌群构成差异无统计学意义(P0.05)。食管癌患者食管蓝藻菌门和疣微菌门的丰度均高于健康对照者(0.2%比0.1%、0.4%比0)，而食管变形菌门、SR1菌门和TM7菌门的丰度均低于健康对照者(21.9%比34.2%、0.1%比0.2%和0.2%比0.5%)，差异均有统计学意义(Q＝0.、0.、0.、0.、0.，P均0.05)。低分化，中分化和高分化食管癌患者食管梭状芽孢杆菌纲、梭状芽孢杆菌目、巴斯德氏菌目、巴斯德氏菌科、埃肯菌属、放线杆菌属和嗜血杆菌属的相对丰度分别为28.3%、24.2%和17.0%，28.3%、24.2%和17.0%，3.2%、0.3%和5.0%，3.2%、0.3%和5.0%，0、1.5%和0.1%，0.5%、0和0.7%，1.3%、0.2%和3.9%，比较差异均有统计学意义(Q＝0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，P均0.05)。LEfSe分析显示，食管癌患者梭杆菌目、瘤胃球菌属、气味杆菌属和S24_7科的丰度均高于健康对照者(21.5%比11.7%、0.5%比0.1%、0.1%比0、0比0)，差异均有统计学意义(LDA值＝2.、2.、2.、2.，P均0.05)。ROC曲线证实随机森林模型可靠，AUC值为0.92。BugBase数据库预测显示，食管癌患者生物膜形成、致病潜力、移动元件、氧需求(厌氧菌、需氧菌、兼性菌)和氧化胁迫耐受食管细菌表型较健康对照者更丰富(P均0.05)。

结论

食管癌患者的食管菌群发生改变，梭杆菌目、瘤胃球菌属、气味杆菌属和S24_7科可作为潜在的菌群标志物。

食管癌发病率居全球恶性肿瘤第7位，病死率居第6位[]。在我国，食管癌发病率居恶性肿瘤第6位，病死率居第4位[]。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC)和食管腺癌2种病理类型，食管癌的确切病因仍未明确。

消化道微生物可能通过诱发慢性或持续性炎症参与肿瘤的发生和发展[]。多项研究表明消化道菌群与食管癌有关。Peters等[]发现口腔福赛斯坦纳菌可增高食管腺癌的发病风险，奈瑟菌和肺炎链球菌可降低食管腺癌的发病风险，牙龈卟啉单胞菌会增高ESCC患病风险。李宁宁等[]发现食管癌患者粪便中厚壁菌门和放线菌门的部分菌种较健康人群显著减少。研究和检测食管菌群或食管特异性细菌的改变，可能有助于ESCC和食管腺癌的早期诊断、转移判断、病情评估和预后评估[]。微生态与食管癌的研究尚处于起步阶段，对食管微生态及其宿主的功能了解有限[]。本研究运用高通量测序技术和生物信息学分析方法，观察食管癌患者与健康对照者食管菌群的特征，初步探索食管癌的关键菌属，为其菌群研究提供理论依据。

对象与方法一、研究对象

选择年7月至年7医院行胸腔镜下食管部分切除术或胃镜检查后经病理确诊的食管癌患者82例，包括ESCC72例，食管腺癌8例，食管神经内分泌癌2例。胸腔镜下食管部分切除术中共获取病理组织30份，其中低分化8份、中分化9份、高分化13份。纳入标准：①年龄≥18岁，组织病理学确诊为食管癌；②全身状况良好，无糖尿病、高脂血症等代谢性疾病和感染性疾病；③近2个月内未服用过抗生素、抑酸药和益生菌等影响食管菌群的药物；④无特殊饮食习惯；⑤无严重肝、肾功能不全和免疫缺陷。排除标准：①近2个月内曾使用过影响食管微生态的药物；②合并自身免疫病；③既往或当前存在食管癌以外的其他肿瘤；④临床资料不全；⑤医师认为不适宜入组。医院胃镜检查结果无异常的20名健康体检者作为健康对照。本研医院伦理委员会审核批准(KS)，所有患者均签署知情同意书。

二、研究方法1．标本采集：

食管癌患者空腹6～8h后行胃镜检查，检查前以温开水漱口，取4～8块食管肿瘤组织，对其中2块组织标本进行标记后置于-80℃保存，剩余组织常规保存于5%甲醛组织固定液。采用上述相同方法采集健康对照者的胃镜下食管黏膜组织。胸腔镜下食管部分切除术组织标本离体后立即于-80℃保存。按照纳入标准选取适宜样本用于后续研究。

2．DNA提取和16SrRNA扩增子焦磷酸测序：

采用PowerMaxDNA提取试剂盒(美国MoBioLaboratories公司)提取样本DNA，以NanoDropND-分光光度计(美国ThermoFisherScientific公司)检测样本DNA的数量和质量，并于-20℃保存备用。

对16SrRNAV4区域行PCR扩增，正向引物序列为5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，反向引物序列为5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反应体系：25μL高保真PCR预混液；引物各3μL(10μmol/L)；10μLDNA模板；6μL双蒸水。循环参数：98℃预变性30s；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1s，25个循环；72℃终延伸1min。PCR产物采用AMPureXPBeads(美国BeckmanCoulter公司)纯化，以PicoGreen双链DNA定量检测试剂盒(美国Invitrogen公司)量化。运用IlluminaHiSeq测序平台(双端测序，2端×bp；美国Illumina公司)测序，由上海宝藤医学检验中心完成。

3．操作分类单元(operationaltaxonomicunit,OTU)聚类分析和物种注释：

应用Vsearch2.4.4软件将物种序列分组为OTU，去除重复序列、聚类和嵌合体，以97%相似度聚类。通过Silva数据库(